液相色譜儀器工作原理

液相色譜法是在經典色譜法的基礎上，引用了氣相色譜的理論，在技術上，流動相改為高壓輸送（zui高輸送壓力可達4.9´107Pa）;色譜柱是以特殊的方法用小粒徑的填料填充而成，從而使柱效大大高于經典液相色譜（每米塔板數可達幾萬或幾十萬）；同時柱后連有高靈敏度的檢測器，可對流出物進行連續檢測。
一、特點：
1．高壓：液相色譜法以液體為流動相（稱為載液），液體流經色譜柱，受到阻力較大，為了迅速地通過色譜柱，必須對載液施加高壓。一般可達150～350×105Pa。
2. 高速：流動相在柱內的流速較經典色譜快得多，一般可達1～10ml/min。液相色譜法所需的分析時間較之經典液相色譜法少得多，一般少于 1h 。
3. ：近來研究出許多新型固定相，使分離效率大大提高。
4.高靈敏度：液相色譜已廣泛采用高靈敏度的檢測器，進一步提高了分析的靈敏度。如熒光檢測器靈敏度可達10-11g。另外，用樣量小，一般幾個微升。
5.適應范圍寬：氣相色譜法與液相色譜法的比較：氣相色譜法雖具有分離能力好，靈敏度高，分析速度快，操作方便等優點，但是受技術條件的限制，沸點太高的物質或熱穩定性差的物質都難于應用氣相色譜法進行分析。而液相色譜法，只要求試樣能制成溶液，而不需要氣化，因此不受試樣揮發性的限制。對于高沸點、熱穩定性差、相對分子量大（大于 400 以上）的有機物（這些物質幾乎占有機物總數的 75% ～ 80% ）原則上都可應用液相色譜法來進行分離、分析。 據統計，在已知化合物中，能用氣相色譜分析的約占20%，而能用液相色譜分析的約占70～80%。
二、性質及原理：液相色譜按其固定相的性質可分為凝膠色譜、疏水性液相色譜、反相液相色譜、離子交換液相色譜、親和液相色譜以及聚焦液相色譜等類型。用不同類型的液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對應的普通液相層析的原理相似。其不同之處是液相色譜靈敏、快速、分辨率高、重復性好，且須在色譜儀中進行。
液相色譜法的主要類型及其分離原理
根據分離機制的不同，液相色譜法可分為下述幾種主要類型：
1 ．液 — 液分配色譜法（Liquid-liquid Partition Chromatography）及化學鍵合相色譜（Chemically Bonded Phase Chromatography） 流動相和固定相都是液體。流動相與固定相之間應互不相溶（極性不同，避免固定液流失），有一個明顯的分界面。當試樣進入色譜柱，溶質在兩相間進行分配。LLPC與GPC有相似之處，即分離的順序取決于K，K大的組分保留值大；但也有不同之處，GPC中，流動相對K影響不大，LLPC流動相對K影響較大。
a. 正相液 — 液分配色譜法（Normal Phase liquid Chromatography）: 流動相的極性小于固定液的極性。
b. 反相液 — 液分配色譜法（Reverse Phase liquid Chromatography）: 流動相的極性大于固定液的極性。
c. 液 — 液分配色譜法的缺點：盡管流動相與固定相的極性要求*不同，但固定液在流動相中仍有微量溶解；流動相通過色譜柱時的機械沖擊力，會造成固定液流失。上世紀70年代末發展的化學鍵合固定相（見后），可克服上述缺點。現在應用很廣泛（70~80%）。
2 ．液 — 固色譜法
流動相為液體，固定相為吸附劑（如硅膠、氧化鋁等）。這是根據物質吸附作用的不同來進行分離的。其作用機制是：當試樣進入色譜柱時，溶質分子 （X） 和溶劑分子（S）對吸附劑表面活性中心發生競爭吸附（未進樣時，所有的吸附劑活性中心吸附的是S），可表示如下：
Xm + nSa ====== Xa + nSm
式中：Xm--流動相中的溶質分子；Sa--固定相中的溶劑分子；Xa--固定相中的溶質分子；Sm--流動相中的溶劑分子。
當吸附競爭反應達平衡時：
K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa]
式中：K為吸附平衡常數。[討論：K越大，保留值越大。]
3 ．離子交換色譜法（Ion-exchange Chromatography）
IEC是以離子交換劑作為固定相。IEC是基于離子交換樹脂上可電離的離子與流動相中具有相同電荷的溶質離子進行可逆交換，依據這些離子以交換劑具有不同的親和力而將它們分離。
以陰離子交換劑為例，其交換過程可表示如下：
X-（溶劑中） + （樹脂-R4N+Cl-）=== （樹脂-R4N+ X-） + Cl- （溶劑中）
當交換達平衡時：
KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]
分配系數為：
DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-]
[討論：DX與保留值的關系]
凡是在溶劑中能夠電離的物質通常都可以用離子交換色譜法來進行分離。